第一作者：王秋岩
通讯作者：王秋岩 裴晓林 谢恬
发表期刊：Communications Biology
期刊5-Year Impact Factor：5.2
通讯单位：杭州师范大学基础医学院 杭州师范大学药学院 吉林大学生科院 杭州师范大学材料与化工学院
论文DOI： https://doi.org/10.1038/s42003-025-08984-y
成果简介
近期，Communications Biology 期刊发表了杭州师范大学王秋岩、谢恬、裴晓林团队联合开展的最新研究成果，论文标题为《PAM-readID is a rapid, simple, and accurate PAM determination method for CRISPR-Cas enzymes in mammalian cells》。该研究创新性地提出了一种名为 PAM-readID 的新技术，无需依赖复杂的荧光分选步骤，仅需极低的测序深度，甚至可通过桑格测序（Sanger sequencing），就能在哺乳动物细胞中快速且精准地解析 Cas 酶的 PAM 图谱。
引言
CRISPR-Cas 核酸酶凭借简便高效特性广泛应用于基因组工程，但受原型间隔序列相邻基序（PAM）限制，且同一 Cas 酶在体外、细菌细胞、哺乳动物细胞中 PAM 谱存在固有差异。目前体外和细菌细胞的 PAM 测定方法已成熟，而哺乳动物细胞作为其核心应用场景，现有方法多依赖荧光报告系统和流式细胞分选（FACS），技术复杂、难以推广，制约了 CRISPR 技术在医学研究和基因治疗领域的应用。本研究基于 GUIDE-seq 中 dsODN 标记切割位点的思路，开发 PAM-readID 方法，旨在解决这一关键瓶颈。
图文导读
（一）PAM-readID 方法设计逻辑（图 1）
传统哺乳动物细胞 PAM 测定依赖荧光报告基因和 FACS 分选，步骤繁琐。PAM-readID 采用 “dsODN 标记 + PCR 富集” 的核心策略：构建含随机 PAM 文库的靶质粒与表达 Cas 酶和 sgRNA 的质粒，共转染哺乳动物细胞并加入 dsODN；Cas 酶识别 PAM 切割靶质粒后，NHEJ 修复会将 dsODN 整合到切割位点；再通过特异性 PCR 富集含可识别 PAM 的产物，最后经测序分析获得 PAM 谱，规避了荧光报告系统和 FACS 的依赖，简化实验流程。
（二）dsODN 整合与 indel 特征分析（图 2）
验证显示，SaCas9 切割产物中近 99% 为单纯 dsODN 整合，SpCas9 约 90% 为 dsODN 整合结合 1bp 插入，两者 PAM 均完整；AsCas12a 因切割产生 5′ 突出末端，虽伴随 1-20bp 缺失，但仍有超 50% 序列保留完整 PAM，筛选后可用于分析，证明该方法能特异性捕获含完整 PAM 的切割产物。
（三）Cas 酶 PAM 偏好性验证（图 3）
PAM-readID 测定的 7 种 Cas 酶 PAM 谱与已知结论高度一致：SaCas9 偏好 5′-NNGRRN-3′，Nme1Cas9 偏好 5′-N4GATT-3′，SpCas9 偏好 5′-NGG-3′，AsCas12a 偏好 5′-TTTV-3′。同时成功捕获 SpG、SpRY 等突变体的 PAM 松弛特性，而这是体外方法 HT-PAMDA 难检测的。
（四）测序深度与方法兼容性（图 4）
该方法测序深度需求极低：SaCas9 需 100 条读段，SpCas9 需 500 条，AsCas12a 仅需 10 条，远低于传统方法。且支持桑格测序，通过 EditR 软件分析色谱图获得的 PAM 谱与高通量测序结果一致，大幅降低技术门槛。
小结
PAM-readID 无需依赖荧光报告系统和 FACS，简化了哺乳动物细胞内 PAM 测定流程；测序深度需求低、成本低，且能准确解析多种 Cas 酶（含突变体）的 PAM 谱，包括经典与非经典 PAM。该方法为新型基因组编辑核酸酶的开发，以及基因治疗中 Cas 酶的选择与优化提供关键支撑，具有重要科研价值和应用前景。
作者简介
第一作者兼通讯作者：王秋岩，博士，副教授，硕士生导师。主要研究方向为酶法药物合成和CRISPR新酶研发，发表SCI文章20余篇，授权专利10余项。曾主持国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、杭州市科技计划及多项企业横向课题。杭州市C类高层次人才，以主要完成人身份曾获得国家科技进步二等奖（第四完成人），教育部科技进步一等奖（第二完成人），国家发明专利金奖（第二完成人）。
