第一作者：王天卓、王敏

通讯作者：马振毅、王天卓

发表期刊：Cell Death & Disease

期刊5-Year Impact Factor：9.60

通讯单位：浙江省全省医学表观遗传学重点实验室、杭州师范大学基础医学院

论文DOI：https://doi.org/10.1038/s41419-025-08332-2

成果简介

2025年12月22日，基础医学院马振毅教授及团队成员王天卓老师等在Cell Death & Disease发表长文“Targeting intrinsically disordered nuclear protein 1 (NUPR1) with single-domain antibodies alleviates triple-negative breast cancer (TNBC) progression in vivo”。文章成功的构建了一个集原位邻近连接筛选（isPLA-seq）、NanoBiT活细胞互补分析和C-degron降解验证的高通量筛选及验证平台，用于筛选抗NUPR1的功能性单域抗体。通过该平台，研究人员筛选出了抗NUPR1的单域抗体#07.81。该单域抗体不仅表现出与NUPR1强大的结合亲和力，并能在三阴性乳腺癌细胞中有效诱导内源性NUPR1蛋白的降解进而起到抑制肿瘤进展的作用，该工作不仅为三阴性乳腺癌提供了一种极具前景的新型治疗策略，也为靶向其他“难成药”的细胞内靶点开辟了新思路。

引言

三阴性乳腺癌是乳腺癌中最具侵袭性的亚型之一，约占全部乳腺癌病例的15–20%。与激素受体阳性及HER2阳性乳腺癌不同，三阴性乳腺癌缺乏有效的靶向疗法，化疗仍是其标准治疗手段。它的关键特征之一在于其依赖应激响应机制，并在恶劣的肿瘤微环境中存活。作为一种应激诱导型无序蛋白，核蛋白1（NUPR1，亦称p8或Com-1）调控多种生物学过程，包括染色质重塑、转录激活、自噬、早熟性衰亡、铁死亡以及应激性压力等。此前本研究组已经揭示了NUPR1通过调控自噬-溶酶体等途径，在非小细胞肺癌及ER⁺乳腺癌耐药中发挥重要作用。值得注意的是，NUPR1高表达与胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、肝癌、肾癌及乳腺癌等多种肿瘤的进展、治疗抵抗及不良预后密切相关，使其成为一个极具潜力的治疗靶点。

单域抗体（single-domain antibody, sdAb；亦称纳米抗体）作为一种新兴治疗手段具有独特优势。其源于骆驼科动物单一重链抗体的可变区，具有分子量小、特异性强、稳定性高等特点。与传统单克隆抗体相比，单域抗体更易穿透肿瘤组织，并可靶向细胞内表位，因此特别适用于如NUPR1这类难靶向分子。此外，其结构简单，易于基因工程改造和大规模生产，进一步提升了临床应用潜力。然而，开发功能性单域抗体需要建立可靠的高通量筛选策略，以确保其特异性与功能活性。

本研究构建了一套基于“原位邻近连接筛选测序（isPLA-seq）—NanoBiT结合检测—C端降解决定子（C-degron）降解验证”的高通量筛选平台，用于发现靶向NUPR1的功能性单域抗体，并为其在三阴性乳腺癌治疗中的潜力提供了有力证据。通过严格的体内外功能验证，本研究为抗NUPR1单域抗体（sdAb#07.81）的临床开发奠定基础。

图文导读

首先，为确认NUPR1在三阴性乳腺癌病理组织中表达情况，我们首先利用三阴性乳腺癌组织芯片进行了免疫组化分析。结果显示，与癌旁组织相比，三阴性乳腺癌组织中NUPR1表达显著升高。此现象与三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231, MDA-MB-468, 4T1 和 BT549）中NUPR1的高蛋白水平相一致，而在ER阳性乳腺癌细胞系（T47D和MCF-7）中表达较低。生存分析进一步表明，在ER和PR阴性乳腺癌患者中，高NUPR1表达与不良预后密切相关。

基于NUPR1在乳腺癌中的关键作用，我们开发了靶向NUPR1的单域抗体高通量筛选平台。我们利用研究组前期构建的单域抗体库，通过名为isPLA-seq的筛选方法筛选抗NUPR1特异性结合的单域抗体，经过三轮筛选，最终富集到17个具有不同CDR3氨基酸序列的单域抗体。进一步的NanoBiT活细胞结合实验结果显示，其中sdAb#07.32、sdAb#07.81和sdAb#31.89在活细胞内展现出较强的与NUPR1特异性结合的信号；其中，sdAb#07.81的信号最强。

为进一步验证这些单域抗体的有效性，我们在多个细胞系中进行了鸟氨酸脱羧酶C端（cOdc1，一种天然的C端降解决定子）降解实验。结果显示，Flag-sdAb#07.32-cOdc1和Flag-sdAb#07.81-cOdc1均能以剂量依赖性的方式降低内源性NUPR1蛋白水平，且sdAb#07.81在所有测试细胞系中均表现出更优的活性。这些发现验证了该高通量筛选平台的有效性，并确立了sdAb#07.81作为进一步开发为三阴性乳腺癌治疗性单域抗体的强效候选分子。

因此，我们成功纯化了抗NUPR1的sdAb#07.81。为探究抗NUPR1 sdAb#07.81在三阴性乳腺癌进展中的作用，我们将4T1细胞皮下注射至BALB/c小鼠体内，并随机分为三组：对照组（PBS）、sdAb-Con组和sdAb#07.81组。每隔三天向瘤内注射纯化的sdAb#07.81蛋白（15 mg/kg）。各组代表性肿瘤图像显示，sdAb#07.81组肿瘤体积明显缩小，肿瘤重量也较对照组和sdAb-Con组显著减轻。进一步的免疫组化Ki67染色显示，sdAb#07.81组肿瘤细胞的增殖受到显著抑制。同时，对4T1肿瘤组织的免疫印迹分析表明，sdAb#07.81处理组中NUPR1蛋白水平较对照组和sdAb-Con组明显降低。为评估sdAb#07.81的体内毒性，我们在超治疗剂量下进行了瘤内给药。监测各组小鼠体重、生存率并对主要器官（心、肝、肾）进行尸检分析。值得注意的是，与对照组和sdAb-Con组相比，即使在30 mg/kg剂量下连续治疗16天，也未观察到明显的毒副作用。综上，这些发现表明sdAb#07.81不仅在体内能有效抑制三阴性乳腺癌进展，而且具有合理的安全性。

先前的研究表明，NUPR1缺失可通过诱导细胞的早熟性衰亡和铁死亡来抑制乳腺癌进展。为探究sdAb#07.81的作用机制，我们首先用不同浓度的sdAb-Con或sdAb#07.81处理4T1和MDA-MB-231细胞，并进行GLB1（早衰标志物）染色。结果显示，随着sdAb#07.81剂量的增加，GLB1染色逐渐加深，表明早衰细胞数量逐渐增多。相比之下，自噬抑制剂氯喹处理可部分逆转GLB1染色加深。免疫荧光结果显示，sdAb#07.81蛋白的加入导致SQSTM1（绿色）蛋白表达上调，与LC3B（红色）的共定位增加，并促进了LC3B点状结构的形成。为检测sdAb#07.81对铁死亡的激活作用，我们通过C11-BODIPY染色和活细胞荧光成像评估脂质过氧化水平。单独使用sdAb#07.81处理即可显著诱导脂质过氧化，而联用已知的铁死亡激活剂RSL3可进一步增强此效应。这些结果与使用sgNUPR1或ZZW-115在三阴性乳腺癌细胞中的效应一致。NUPR1可通过诱导铁螯合蛋白脂质运载蛋白-2（LCN2）的表达来保护癌细胞免受过量铁的影响。CCK-8实验显示，添加sdAb#07.81能显著抑制由LCN2过表达所促进的细胞增殖，其效果与敲低LCN2相似。值得注意的是，sdAb#07.81与RSL3联用可观察到协同抑制效应。综上，这些发现表明sdAb#07.81通过同时促进早衰和铁死亡通路来抑制肿瘤进展。

小结

  本研究成功建立了一个基于isPLA-seq—NanoBiT结合检测—C端降解决定子（C-degron）降解验证的能够高效筛选靶向细胞内蛋白的单域抗体平台，并鉴定出具有明确治疗效果的抗NUPR1单域抗体sdAb#07.81。该工作不仅为三阴性乳腺癌提供了一种极具前景的新型治疗策略，也为靶向其他“难靶向”的细胞内靶点开辟了新路径。

作者简介

第一作者：王天卓（杭州师范大学基础医学院生物化学与分子生物学系青年教师,右二）；王敏（杭州师范大学基础医学院2022级硕士研究生，导师马振毅教授，已毕业；目前在生物公司从事抗体研发工作）。

主要参与作者：陈宣儒（杭州师范大学基础医学院2023级硕士研究生；导师刘喆教授，左一）；殷曰苑（天津医科大学基础医学院博士毕业生，导师马振毅教授；目前在山东大学齐鲁第二医院工作）。

通讯作者：马振毅

马振毅，教授，博士生导师。主要从事实体肿瘤转移过程中细胞自噬异常的调控机制研究，在肿瘤细胞自噬调控方面研究取得显著成绩，其研究成果揭示SNARE复合物是潜在肿瘤恶性转变的治疗靶点。近年来重点关注单域抗体筛选新方法的建立。主持6项目国家自然科学基金，发表研究论文20多篇。